概述
由首都医科医院疑难肝病及人工肝中心、肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室段钟平教授、陈煜教授科研团队承担的《肝爽颗粒浸膏减轻对 酚所致肝细胞损伤的作用机制》课题结题，论文发表于《临床肝胆病杂志》年1月第37卷第1期。该课题主要探讨肝爽颗粒浸膏减轻对 酚(N－ 基－对 ，APAP)诱导的肝细胞*性的能力，以及可能涉及的机制。研究结论有力地证实肝爽颗粒浸膏可通过两种途径预防APAP诱导肝脏损伤， 种途径是肝爽颗粒浸膏下调CYP2E1/1A2的表达减少了APAP*性产物NAPQI的生成;第二种途径是肝爽颗粒浸膏上调解*通路的表达，激活Nrf2增加抗氧化酶(SOD、GSH)和Ⅱ相酶的表达，从而加速APAP的无害代谢。研究背景
对 酚(N－ 基－对 ，APAP)是用于镇痛和解热的常用药物，但过量服用时有很高的*性，并可以导致急性肝衰竭。在欧美国家，高剂量的APAP是药物引起肝损伤的主要原因。在中国，APAP诱发了约0．40%的药物性肝损伤。目前临床治疗药物有限，其 药 半胱氨酸治疗窗狭窄，迫切需要寻找安全有效的治疗药物。APAP在体内的代谢涉及肝脏Ⅰ相和Ⅱ相酶相关解*途径。在肝Ⅱ相结合酶［包括UDP－葡糖醛酸糖基转移酶(UDP－glucosyltransferase，UGT)和磺基转移(sulfotransferases，SULT)］的作用下大约85%的APAP被处理为APAP－gluc和APAP－sulfur，并通过尿液排出。目前广泛认为APAP的*性产物N－ 基－对苯醌 (N－Acetyl－p－benzo－quinonei-mine，NAPQI)主要是通过肝Ⅰ相反应通过细胞色素P(CYP)途径(主要是通过CYP2E1/CYP1A2)产生的。在APAP过量的情况下，Ⅱ相反应变得饱和，但NAPQI的过量产生会耗尽肝谷胱甘肽(GSH)并修饰细胞蛋白。这破坏了氧化还原平衡，造成了线粒体损伤，从而导致氧化应激引起的肝损伤。
肝爽颗粒是临床上常见的保肝药物，主要功能为疏肝健脾、清热散瘀、保肝护肝、软坚散结，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝损伤。有前期研究表明，肝爽颗粒对慢性肝损伤患者具有保护性作用，但其具体机制仍不清楚。目前，氧化应激和线粒体功能障碍被认为是APAP肝细胞*性的主要细胞过程，因此，抑制氧化应激和改善线粒体功能在减轻APAP诱导的急性肝损伤中具有重要作用。肝爽颗粒及其主要有效成分(柚皮苷)可以抗氧化及降低CYP2E1表达的作用，据此笔者推测肝爽颗粒可以有效改善APAP引起的肝损伤。为此建立了体外APAP损伤的细胞模型(HepG2细胞)，验证肝爽颗粒的细胞保护作用及抗氧化作用，检测氧化应激相关指标［GSH、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ＲOS)］，观察肝爽颗粒对APAP代谢相关的Ⅰ相酶(CYP2E1/1A2)和Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6/2B7、GSTα1/m1、SULT1A1/2A1)的影响，探讨其对线粒体功能［线粒体膜电位、上清谷氨酸脱氢酶(GDH)］的影响，并进一步对机制进行研究，从而为临床治疗提供依据。实验方法及步骤
设立5组细胞培养组，分别为正常对照组、APAP损伤组、3组不同肝爽颗粒浸膏浓度的损伤保护组。使用20mmol/LAPAP加入细胞培养液孵育24h构建造体外药物肝损伤模型，损伤保护组提前加用不同浓度肝爽颗粒浸膏(0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml)8h孵育后加入APAP损伤24h。检测不同组别的肝细胞损伤标志物(ALT、AST、LDH)、线粒体损伤标志物(线粒体膜电位、GDH)、抗氧化及氧化应激标志物(GSH、SOD、MDA、ＲOS)等。进一步针对实验结果进行机制探讨。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD－t检验。
ABOUTCONCLUSION
关于结论
1.肝爽颗粒浸膏对APAP引起的肝细胞*性的影响
APAP组细胞活力明显下降，经肝爽颗粒浸膏预处理后，细胞活力得到改善，尤其1μg/ml及5μg/ml两组与APAP组比较有明显统计学差异(P值均＜0.05)。加入APAP后细胞培养上清中的AST、ALT、LDH含量显著上升，而肝爽颗粒浸膏的预处理组明显下降，提示肝爽颗粒体外可以保护APAP引起的肝细胞损伤(P＜0.05)。2.肝爽颗粒浸膏对APAP诱导的肝脏氧化应激指标的影响
与对照组相比，加入APAP导致细胞内MDA、ＲOS水平显着增加，GSH水平降低(P值均＜0.05)，表明APAP引起了肝细胞的氧化应激反应。APAP还将SOD活性水平降低了20%。肝爽颗粒浸膏预处理以剂量依赖性方式显著阻止了APAP的所有作用。3.肝爽颗粒浸膏对APAP诱导的肝细胞线粒体损伤的影响使用高内涵荧光实时监测APAP诱导的肝细胞线粒体膜电位变化，可见3h对照组荧光强度随着细胞的增殖强度变强，而APAP损伤造成荧光强度降低，肝爽颗粒浸膏预处理以剂量依赖性方式增强了线粒体膜电位，保护了线粒体膜的稳定性。为了进一步验证肝爽颗粒浸膏对线粒体损伤的保护作用，检测了不同组别上清中GDH的含量，可见1μg/ml及5μg/ml肝爽颗粒浸膏处理组的GDH显著下降。
4.肝爽颗粒浸膏对CYP2E1/1A2表达的影响通过ＲT－PCＲ检测CYP2E1/1A2mＲNA表达水平，观察到单独使用APAP可以提高CYP2E1/1A2mＲNA水平。而与此同时，1μg/ml及5μg/ml肝爽颗粒浸膏可以抑制CYP1A2表达，同时显著抑制CYP2E1表达。
5.肝爽颗粒浸膏对肝细胞Ⅱ相酶表达的影响(注:与APAP组相比，*P＜0．05，＊＊P＜0．)
如上图所示，Ⅱ相酶水平受 剂量的肝爽颗粒浸膏影响。与对照组相比，单用APAP显著下调了肝脏Ⅱ相酶的表达。同样，肝爽颗粒浸膏以剂量依赖性方式使Ⅱ期酶的mＲNA水平升高。最终剂量为5μg/ml的损伤保护组显著选择性地上调了Ⅱ期酶的靶基因，导致上调程度比对照组高%、%、%和%分别为UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6和SULT2A1。
6.肝爽颗粒浸膏可以诱导Nrf2及其下游基因的表达
(注:WesternBlot检测不同组别Nrf2蛋白水平表达结果)
使用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCＲ检测肝细胞系中Nrf2的表达。与对照组相比，在预处理组中，Nrf2的蛋白质水平及mＲNA水平显示均展现出上升的趋势(P值均＜0.05)。此外，与单独的APAP组相比，1μg/ml及5μg/ml肝爽颗粒浸膏预处理组的GCLC及NQO－1(Nrf2的靶基因)mＲNA水平的表达显著增强(P值均＜0.05)。
结论：
综上所述，肝爽颗粒浸膏作为一种天然药物的复合物，对APAP的解*有着有益的影响，并通过Nrf2的激活，与CYP2E1活性的抑制以及抗氧化酶和Ⅱ期酶的上调有关。总之，肝爽颗粒是一种有希望用于治疗APAP引起的肝损伤药物。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
